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Product Category外泌體(ti) 是納米級的細胞外囊泡，主要調節細胞間通訊。它們(men) 在納米醫學中具有巨大的應用潛力。然而，其分離技術因為(wei) 昂貴儀(yi) 器和試劑受到限製。仿生納米技術為(wei) 藥物、RNA幹擾（RNAi）、蛋白質遞送和無藥物療法提供強大的支架，極大地影響了生物醫學。在大流行期間，納米技術在世界範圍內(nei) mRNA疫苗和診斷試劑盒的開發中發揮了重要作用。然而，傳(chuan) 統納米材料在臨(lin) 床的轉化因靶點識別能力差和成本高昂從(cong) 而受到影響。在這方麵，外泌體(ti) 可能是解決(jue) 上述問題的一個(ge) 不錯選擇。
外泌體(ti) 是細胞外囊泡，大小範圍為(wei) 30-200 nm，幾乎所有類型的細胞都會(hui) 分泌。它們(men) 通過攜帶DNA、RNA、RNAi、蛋白質、病毒、脂質、小分子和可溶性因子等多種有效載荷參與(yu) 細胞間通訊。這些物質以旁分泌方式從(cong) 親(qin) 本（供體(ti) ）輸送到受體(ti) 細胞。外泌體(ti) 繼承了有效載荷傳(chuan) 遞能力，這使它們(men) 成為(wei) 藥物輸送的理想載體(ti) ，通過將所需的物質裝載在其內(nei) 部或表麵。外泌體(ti) 也可用作某些疾病的診斷標誌物，例如神經退行性疾病和癌症。外泌體(ti) 還有穿越體(ti) 內(nei) 所有生理屏障的能力，以及與(yu) 血腦屏障（BBB）相關(guan) 的能力，這在改善腦部疾病或切除腦癌方麵存在重大意義(yi) 。外泌體(ti) 可以從(cong) 所有體(ti) 液中分離出來，包括血漿、尿液、腦脊液、羊水、胸腔積液、腹水、支氣管肺泡杠杆、細胞培養(yang) 等，它們(men) 大量存在於(yu) 所有體(ti) 液中。基於(yu) 外泌體(ti) 的無細胞療法具有高濃度和易於(yu) 進入細胞和器官的特點，在生物醫學中具有顯著的優(you) 勢。
有幾種有效的外泌體(ti) 分離方法，包括原型超速離心（用於(yu) 80%的細胞外研究）、通過聚乙二醇（PEG）的密度梯度試劑、尺寸排阻色譜（SEC）和免疫沉澱等。然而，這些方法有一定的局限性，即超速離心機或商業(ye) 試劑盒的成本高。此外，分離的外泌體(ti) 樣品的純度、大小和濃度及其功能取決(jue) 於(yu) 所采用的分離方法。
凍幹（真空冷凍幹燥）現在通常用於(yu) 延長富集外泌體(ti) 的儲(chu) 存時間。目前，它在外泌體(ti) 分離中的應用是比較新穎的。有趣的是，大多數外泌體(ti) 儲(chu) 存緩衝(chong) 液都有一個(ge) 維持其結構和功能的方法。例如，4%海藻糖或10% w/v山梨糖醇和蔗糖有利於(yu) 富集外泌體(ti) 顆粒的冷凍幹燥。同樣，理想的pH值為(wei) 6.5-7.5，氨基酸、穀氨酸和1%FBS對外泌體(ti) 的凍幹過程是有利的，以避免冷凍休克並保持外泌體(ti) 顆粒的結構完整性。同樣，對於(yu) 細胞培養(yang) 基，Dulbecco改良的Eagle培養(yang) 基（DMEM）富含葡萄糖，pH值為(wei) 6.8-7.4，主要富含L型穀氨酸，並補充10%FBS。與(yu) 凍幹的外泌體(ti) 顆粒儲(chu) 存培養(yang) 基類似，也就是說細胞培養(yang) 基可以保護外泌體(ti) 。因此，基於(yu) 凍幹的技術能夠通過冷凍幹燥老化的細胞培養(yang) 基來分離外泌體(ti) 。然而，我們(men) 仍然需要依靠傳(chuan) 統的外泌體(ti) 分離技術進行洗滌。盡管SEC或超速離心可以在一定程度上達到這種效果，但沒有一種分離方法可以純化外泌體(ti) 樣品免受蛋白質汙染。
外泌體(ti) 分離技術的比較研究評估了用於(yu) 外泌體(ti) 純化的各種商業(ye) 試劑盒的效率、純度和可重複性及其在血漿和血清樣品中的 miRNA 質量。發現血清適合外泌體(ti) 的分離，並且具有更多種類的外泌體(ti) miRNA。研究還發現，每種分離方法在純度、外泌體(ti) 數量和種類含量方麵都存在一定的局限性。相比之下，血漿更有利於(yu) 外泌體(ti) 分離。對於(yu) 所有類型的外泌體(ti) 樣本，與(yu) 商業(ye) 試劑盒相比，即使是超速離心也受到產(chan) 量較低的限製，但純度相對較高。研究表明，外泌體(ti) 貨物的檢測和分離取決(jue) 於(yu) 所采用的分離程序。基於(yu) 凍幹外泌體(ti) 的分離方法因其簡單性和成本效益而是一種不錯的選擇。
外泌體(ti) 掃描電子顯微照片，比例尺：200 nm
使用凍幹方法分離外泌體(ti) ，並使用掃描電子顯微鏡 （SEM） 表征大小和形狀。此外，納米顆粒追蹤分析（NTA）用於(yu) 準確揭示樣品中外泌體(ti) 的濃度和大小。貼壁細胞係和懸浮細胞係的細胞外囊泡平均大小均約為(wei) 140 nm，這與(yu) 報道的外泌體(ti) 大小（30-200 nm）相符。基於(yu) 蛋白質的外泌體(ti) 的平均濃度可滿足下遊應用。一般外泌體(ti) 表麵的蛋白標記物被認為(wei) 是其表征的標準。例如，CD9、CD63 和 CD81 是內(nei) 體(ti) 特異性四跨膜蛋白。CD9首先在從(cong) 樹突狀細胞中分離的外泌體(ti) 上被發現。TSG101和HSP70是轉運複合物所需的內(nei) 體(ti) 分選複合物（ESCRT）複合物的組成部分，在外泌體(ti) 生成中起著重要作用。鈣聯蛋白（Calnexin）是一種內(nei) 質網標誌物，主要被評估為(wei) 外泌體(ti) 的陰性對照，主要存在於(yu) 相對較大的囊泡上，而CD63存在於(yu) 較小的囊泡上。Western blot試驗證實，除鈣聯蛋白外，所有這些重要標記物都存在於(yu) 分離的外泌體(ti) 表麵。
外泌體(ti) 在納米醫學中的應用有利於(yu) 藥物遞送和診斷。研究人員通過用達沙替尼和普納替尼負載這些分離的外泌體(ti) 來評估這些外泌體(ti) 的藥物負載和釋放能力（達沙替尼和普納替尼被用作Ph+白血病的酪氨酸激酶抑製劑），觀察到外泌體(ti) 可以有效地負載藥物並將藥物遞送至靶細胞。藥物釋放研究是通過在不同時間點收集樣本在體(ti) 外進行的。在8 h時，藥物釋放最佳，而在12 h時觀察到下降。研究結果證實了這一點，因為(wei) K562是一種白血病細胞係，具有較低的pH值，這會(hui) 觸發藥物從(cong) 外泌體(ti) 釋放。
實驗樣本：外泌體(ti)
實驗目的：去除所有水分，保持樣品美觀，方便保存及下一步試驗
實驗設備：
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實驗過程：
1、打開凍幹機預冷，設置好凍幹程序包括預凍和升華程序。
2、對樣品進行前處理，加入合適的保護劑進行預凍。如葡聚糖，甘露糖，海藻糖，複合保護劑。將樣品分裝到合適的容器內(nei) ，放置於(yu) 凍幹機隔板上，Mercury凍幹機隔板均勻度達到了±1°C，可保證樣品的均一凍幹狀態。
3、啟動設置好的凍幹程序，即預凍至-45℃，持續時間5h。升華程序-45℃～20℃，持續時間32h。此步驟可以利用凍幹終點判斷功能，預估完成時間，可縮短反複查看的時間。
4、程序結束後，釋壓取出凍幹好的樣品，觀察樣品狀態是否達到預期。如果達到隨即儲(chu) 存或者進行後續實驗。
實驗結果：無保護劑組，外泌體(ti) 直接凍幹，凍幹後比較鬆散。加入5%甘露醇後樣品更為(wei) 美觀，且保存效果好。
凍幹前後對比圖如下：
凍幹前 VS 凍幹後
左3為(wei) 加入甘醇後樣品
