【凍幹小課堂】常見的凍幹保護劑

凍幹保護劑的主要功用是降低冷凍和融化過程對脂質體(ti) 的損害，研究較多的質體(ti) 凍幹保護劑有單糖、二糖、寡聚糖、多糖、多元醇及其他水溶性高分子物質等。各種保護劑的保護機製不盡相同，如甘露醇可增加黏度、降低水的結晶速率及內(nei) 水相形成冰晶共熔點溫度;D-葡萄糖在凍結時可在水相的冰晶生長空隙濃縮並覆蓋在脂質體(ti) 表麵，使冰晶不能嵌入脂質體(ti) 的雙分子層膜;而海藻酸是通過氫鍵與(yu) 磷脂的極性基團結合來穩定凍結時的脫水膜，有效取代了在極性基團周圍的殘餘(yu) 水分，還可增加空間效應，降低相變溫度。保護劑的用量一般為(wei) 2%~5%(w/v)。凍幹保護劑對脂質體(ti) 的保護作用與(yu) 其用量、凍幹工藝、脂質體(ti) 及藥物的性質等因素有關(guan) 。

對於(yu) 脂質體(ti) 的凍幹，一般用糖類物質作保護劑。糖類保護劑在凍結過程中主要在以下幾個(ge) 方麵對脂質體(ti) 具有保護作用。

1、阻止融合

通過凍幹保護劑減少囊泡與(yu) 囊泡之間的接觸附著以阻止融合。隨著脂質體(ti) 混懸液的凍結和冰晶的生長，保護劑逐漸濃縮，並分布在脂質體(ti) 囊泡周圍,可作為(wei) 間隔基質阻止囊泡之間的融合和藥物的泄漏。

2、抑製冰晶生長

保護劑可以抑製冰晶的生長,減小冰晶嵌入脂質體(ti) 雙層膜的幾率，減少冰晶對脂質體(ti) 囊泡的損傷(shang) ，可防止膜破裂。

3、提高轉變溫度

保護劑可以提高脂質體(ti) 混懸液的玻璃化轉變溫度、並在一定的降溫速率下，使脂質體(ti) 混懸液實現部分玻璃化，避免了結晶，減少了由於(yu) 冰晶生長而引起的各種損傷(shang) 。

4、黏性增強

在脂質體(ti) 混懸液凍結過程中，糖類保護劑使溶液的黏性增加，從(cong) 而弱化了水的結晶過程，達到了保護的目的。

5、形成氫鍵

凍幹保護劑可與(yu) 脂質體(ti) 磷脂的極性基團形成氫鍵，脫水後代替水作為(wei) 脂質體(ti) 的穩定劑，保持脂質體(ti) 膜的完整性，抑製藥物的滲漏，這種機製稱為(wei) “水替代假說"。在無凍幹保護劑的情況下，凍幹會(hui) 使

凍幹脂質體(ti) 的相轉變溫度大幅提高，而加入糖類保護劑後，可在膜界麵的極性區域代替失去的水，避免了Tm的這種劇烈變化。隨凍幹條件的不同，Tm可高於(yu) 或低於(yu) 水化脂質體(ti) 的相轉變溫度（Tc）。

糖與(yu) 磷脂間的相互作用越強，Tm越低，保護作用就越強。Tm降低的程度與(yu) 凍幹品的穩定性有較好的相關(guan) 性。

概括地講，在脂質體(ti) 的幹燥過程中，保護劑需滿足兩(liang) 個(ge) 基本條件:

1、具有相當高的玻璃化轉變溫度Tg'，對此條件要求較高。

2、能夠與(yu) 脂質雙分子層發生很好的相互作用。混合保護劑也需要滿足這個(ge) 要求。如單獨使用葡萄糖或澱粉(HES)作保護劑凍幹時，蛋磷脂脂質體(ti) 不穩定，但兩(liang) 者聯合使用可獲得較好的凍幹效果。

在凍幹過程中，兩(liang) 者分別發揮不同的作用，葡萄糖可與(yu) 磷脂發生相互作用，而HES與(yu) 脂質雙分子層不發生相互作用，但它提供了一個(ge) 較高的Tg'。兩(liang) 者混合使用亦可用於(yu) 紅細胞的凍幹。

常見的凍幹保護劑

1、單糖

主要有葡萄糖、甘露糖、半乳糖及果糖等。葡萄糖對凍融過程中脂質體(ti) 的形態、粒徑和包封率有較好的保護作用，但玻璃化轉變溫度(Tg')較低，單用時得到的凍幹產(chan) 品常出現明顯的藥物滲漏。甘露糖、

半乳糖及果糖等對脂質體(ti) 的保護作用與(yu) 葡萄糖類似。

2、二糖

二糖是研究最多也是有效的凍幹保護劑，常用的有海藻糖、麥芽糖、蔗糖及乳糖。其中海藻糖為(wei) 非還原性二糖，可在無水條件下保護生物膜功能、維持鈣離子的正常膜轉運，也可使脂質體(ti) 在脫水時保持完整形態。其他二糖隻有在大於(yu) 生理濃度時才具有較好的脫水保護作用、Crowe等研究表明，棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿-磷脂酰絲(si) 氨酸(PS)脂質體(ti) 直接凍幹會(hui) 引起大部分甚至全部水溶性藥物滲漏，但若在

凍幹前分別在肪質體(ti) 的內(nei) 、外水相中加入適量海藻糖、則凍幹品複水後藥物的保留率與(yu) (Retenton%)在95%以上。同時發現，抑製脂質體(ti) 融合比抑製藥物滲漏所需的海藻糖濃度小得多(1/10以下)。

直接凍幹也會(hui) 引起蛋黃卵磷脂(EPC)脂質體(ti) 的聚集和粒徑增大，用海藻糖作保護劑時，複水後脂質體(ti) 的粒徑無顯著變化。海藻糖、麥芽糖及蔗糖對二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)脂質體(ti) 的凍幹保護作用相近、

複水後粒徑無顯著變化，水溶性藥物的保留率約90%，顯著優(you) 葡萄糖、半乳糖和甘露糖。Van Winden 等分別采用海藻榶、蔗糖、乳糖及麥芽糖為(wei) 保護劑製備多柔比星凍幹脂質體(ti) ，複水後粒徑無顯著變化，

藥物保留率均在90%以上。將蔗糖和脂肪酸以共價(jia) 鍵結合製備脂肪酸蔗糖酯，考察了含有該膜材的EPC和氫化蛋黃卵磷脂脂質體(ti) 在凍融和複水過程中的穩定性。結果表明、單用脂肪酸蔗糖酯不能抑製羧基熒

光素的滲漏。若再加人5%蔗糖，複水後脂質體(ti) 中羧基熒光素的保留率可達 95%。

3、寡聚糖

研究表明，葡萄糖對二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)和EPC脂質體(ti) 中鈣黃綠素滲漏的保護作用較弱，單用時還會(hui) 引起一定程度的脂質體(ti) 聚集和融合，但對DPPC脂質體(ti) 具有相對較高的保護作用，而麥芽糖和麥芽三

糖對EPC脂質體(ti) 的護作用較高。類似研究表明，用麥芽三糖(maltotriosese)作保護劑得到的凍幹脂質體(ti) 複水後藥物保留率可達90%，其他麥芽糖糊精(maltodextrins)的保護效果隨葡萄糖殘基數目的增大而降低。

Cycloinulohexaose(CF-6)能有效抑製凍幹過程中脂質體(ti) 的融合及藥物滲漏，複水後脂質體(ti) 的粒徑分布無顯著變化，水溶性藥物的保留率可達 85%以上。若加入適量甘油、乙二醇、丙二醇、甘氨酸及脯氨酸等

更可增強其凍幹保護能力，複水後藥物保留率可達90%，其機製可能附加劑的存在使脂質與(yu) CF-6間的氫鍵比增加有關(guan) 。

4、多元醇

Tanaka 等研究了山梨醇、肌醇和甘露醇等多元醇對脂質體(ti) 的凍幹保護作用，結果表明多元醇的作用均比二糖差，凍幹產(chan) 品均有明顯的聚集。以肌醇和山梨醇為(wei) 保護劑的凍幹品複水後粒徑顯著增大，且藥物滲漏嚴(yan) 重；

甘露醇體(ti) 係中藥物幾乎全部滲漏。但甘露醇的低共熔溫度較高，常用作輔助保護劑以保持凍幹品的良好外觀。

5、多種保護劑合用

聯合應用兩(liang) 種或兩(liang) 種以上的保護劑可獲得比單用時更好的效果。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、PEG、多糖、澱粉及纖維素衍生物等水溶性高分子物質也可與(yu) 上述保護劑合用。將果聚糖或澱粉與(yu) 葡萄糖合用，載水溶性

藥物的凍幹EPC脂質體(ti) 複水後的保留率可達85%以上。海藻糖單用時，凍幹甲氨蝶呤鈉脂質體(ti) 複水後保留率為(wei) 63%，與(yu) PEG合用時可提高到70%以上。另外，硼酸鹽離子或無機磷酸鹽和海藻糖在幹燥狀態下可形成複合物，從(cong) 而提高海藻糖的Tg'。